干貨|ELISA實驗做不好，索萊寶FAQ來幫你

更新時間：2021-01-15

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2020年就像一列疾馳的列車，雖然經(jīng)歷彷徨、迷茫，但終于駛過寒冬，駛向春天。2021帶著我們美好的愿望如期而至。在新年的伊始，我們?yōu)榇蠹宜蜕狭薊LISA的一些大干貨，趕緊收藏起來吧!

ELISA原理

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）指將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的有無深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA常見分類

直接ELISA

特點：在直接ELISA中，抗原被固定在多孔板表面，用一種針對該抗原的抗體檢測，該抗體直接與HRP或其他檢測分子結(jié)合。

優(yōu)點：簡單快速，避免交叉反應(yīng)。

缺點：潛在高背景，沒有信號放大。

間接ELISA

特點：固相載體包被抗原，酶標(biāo)記二抗，主要用于測抗體。

優(yōu)點：使用酶標(biāo)二抗增加了靈敏度，靈活度大，成本低。

缺點：交叉反應(yīng)幾率升高。

用途：通過檢測血清中的抗體來檢測病毒，如第1，2代艾滋病診斷試劑。于免疫動物血清中抗體含量的測定。

雙抗夾心ELISA

特點：使用兩個特異性單抗或者1個特異性單抗和1個特異性多抗，固相載體包被抗體，酶標(biāo)記特異性抗體作為檢測抗體。

優(yōu)點：使用兩個特異性抗體檢測，特異性好。

缺點：成本高。

用途：用于抗原的定量檢測。

競爭ELISA

特點：包被抗體，標(biāo)記抗原，樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，后的顯色也越淺。

缺點：整體的敏感性和專一性都較差。

用途：小分子抗原或者半抗原的定量檢測，當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時，多用于此方法檢測；一般小分子激素及藥物常用此法測定。

ELISA常見問題

為什么推薦雙波長檢測(450nm和630nm)？

A：ELISA實驗終止后形成的是黃色物質(zhì)，該物質(zhì)需要在450nm處測定其吸光度，630nm的吸光度只是檢測板子本身的吸光度，與酶標(biāo)板的材質(zhì)有關(guān)，測OD630可以消除各個板孔不干凈等非特異性因素引起的誤差。如果所使用的酶標(biāo)儀不可以檢測OD630也沒有關(guān)系，只讀取OD450的結(jié)果也可以。

數(shù)據(jù)處理時所用的矯正值，是把所有孔的OD值減去標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度孔的OD值，進(jìn)一步計算結(jié)果。

CV值指的是什么？

A：CV值是統(tǒng)計學(xué)中的一個概念，中文是變異系數(shù)，可以認(rèn)為變異系數(shù)和極差、標(biāo)準(zhǔn)差和方差一樣，都是反映數(shù)據(jù)離散程度的值。CV值越小，說明數(shù)據(jù)的波動程度越小。在描述板內(nèi)、板間實驗結(jié)果是否一致時常用到CV值，其越小，說明批內(nèi)及批間差越小，試劑盒質(zhì)量越好。

標(biāo)曲擬合方式的方法？

A：ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標(biāo)準(zhǔn)曲線”其實稱為擬合曲線比較合適。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式有多種，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而四參數(shù)Logistic曲線擬合則對曲線的全部都有較好的適用性。目前上的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)Logistic擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較正確地獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。

建議用專門的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，這樣可以快速、準(zhǔn)確地計算出結(jié)果。

明確標(biāo)明種屬的試劑盒可以用來檢測其他

種屬的樣本嗎？

A：ELISA試劑盒嚴(yán)格區(qū)分種屬，一般不推薦跨種屬檢測，不同種屬的同一個指標(biāo)同源性相差可能會很大，抗體的特異性要求比較高，不同種屬樣本與抗體結(jié)合能力會有很大差別。

ELISA試劑盒只能檢測血清、血漿、細(xì)胞

上清液嗎？

A：通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，包括血清、血漿、細(xì)胞上清等常規(guī)樣品，而對于尿液、細(xì)組織勻漿液、細(xì)胞裂解液等樣品，目前市面上很多廠家的產(chǎn)品都沒有相關(guān)的驗證數(shù)據(jù)，理論上可以檢測，客戶如有需要可以自行測試。需要注意的是，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質(zhì)會影響檢測結(jié)果。

試劑盒在使用前要室溫放置30min，目的

是什么？

A：ELISA試劑盒對于溫度的要求比較嚴(yán)格，溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，這樣做主要是為了使試劑溫度一致，在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地滿足測定要求。

樣本收集后不能及時檢測，低溫保存可以

放多久？

A：樣本收集后24之內(nèi)進(jìn)行檢測，放在4℃冰箱即可。如果樣本收集后不能立即檢測，需將樣本置于低溫冰箱中，樣本3個月內(nèi)檢測可于-20℃保存，若需存放時間更久，需要-80℃冰箱保存。

樣品反復(fù)凍融影響大嗎？

A：樣品反復(fù)凍融對蛋白影響非常大，能導(dǎo)致蛋白降解，非常不建議反復(fù)凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復(fù)凍融1-2次，對于檢測結(jié)果影響不是非常大，但是其他類型的樣本，例如細(xì)胞上清液、肺泡灌洗液，反復(fù)凍融會使蛋白降解嚴(yán)重，對檢測結(jié)果影響非常大。

生物素化抗體和酶結(jié)合物，稀釋后沒用完，

還可以再用嗎？

A：稀釋后的生物素化抗體和酶結(jié)合物建議在當(dāng)天用完，放置時間太長可能會影響其活性。可根據(jù)自己實驗所需用量進(jìn)行配制，不建議過量配制。

Q10

變異系數(shù)(CV)較大的原因？

A：