實時定量技術，是指在PCR體系中加入赫斯特熒光染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個進程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　

　　該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有特異性強、自動化程度高等特點。因此已得到廣泛應用。

　　

　　熒光染料的諸多特點使它可以用于多種應用，包括：qPCR，高分辨率DNA熔解曲線（HRM）分析，常規(guī)的DNA定量以及毛細管電泳。當染料和DNA結合后，其激發(fā)和發(fā)射光譜與熒光素以及熒光染料相似。

　　

　　這使得該染料可以直接用于配置了488nm氬離子激光器或者此光譜區(qū)域內(nèi)任何可見光激發(fā)裝置的儀器。本身沒有熒光，但和dsDNA結合后能發(fā)出高亮度的熒光，這種特性使它特別適合于實時定量PCR的應用。

　　

　　另外，水溶性溶劑，如DMSO或者甘油，常被用來作為添加劑以穩(wěn)定。這些組分以及pH值需要根據(jù)您所選用的聚合酶的特性進行優(yōu)化。如果您使用常規(guī)非熱啟動Taq聚合酶，并配合使用，您將會獲得比熒光染料更優(yōu)的實驗結果。

　　

　　由于各種儀器的光學設置不同，因此當平行比較時，在不同儀器上的Ct值會有＋1或－1的微小差別。然而無論您使用哪種儀器，赫斯特熒光染料的熔解曲線分析中的熒光強度都遠強于。