細胞發(fā)生衰老的表征變化

細胞，又稱“萬能細胞"，是一種未充分分化、尚不成熟的細胞，在適當條件下，具有再生各種組織、器官的潛能，因此被寄予厚望，干細胞研究也多次進入國自然研究熱點排行榜前列。間充質干細胞（MSC）具有多向分化的潛能，體外在一定條件下可以誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞，2006年國際細胞治療協(xié)會（ISCT）確定此三項檢測指標是MSC鑒定的必檢項目，MSC的三系誘導在生物醫(yī)藥領域一直深受各位科研人員的青睞和應用。

如何構建細胞衰老模型？

可引起細胞衰老的因素有很多，我們主要介紹一下目前常見的兩種細胞衰老模型構建方式，一種為D-半乳糖（D-gal）誘導的細胞衰老模型，另一種為雙氧水誘導的細胞衰老模型。D-半乳糖誘導的細胞衰老模型為通過加入一定濃度的D-半乳糖引起自由基損傷，從而導致線粒體功能失調(diào)，最后造成細胞衰老；雙氧水誘導的細胞衰老模型為過氧化氫作為氧化劑可造成細胞的氧化應激使其代謝失調(diào)，最終導致細胞衰老。  
     

半乳糖誘導的細胞衰老模型建立     
    

1. 細胞培養(yǎng)      

選擇合適的細胞系，如人胚肺成纖維細胞（HELF）、小鼠成纖維細胞（L929）等。將細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，使用適宜的培養(yǎng)基，如含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期。

    
2. D -半乳糖溶液配制      

稱取適量的 D-半乳糖，用無菌 PBS 或培養(yǎng)基溶解，配制成所需濃度的溶液。一般常用的濃度范圍在10-100mmol/L 之間，具體濃度可根據(jù)不同細胞類型和實驗目的進行優(yōu)化。例如，對于HELF細胞，可嘗試50mmol/L的D-半乳糖溶液。溶液需經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩? 

  
3. 誘導處理      

當細胞生長至合適密度（如80% - 90%匯合度）時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2 - 3次。然后加入含D -半乳糖的培養(yǎng)基，使 D-半乳糖終濃度達到設定值。將細胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導時間通常為7- 14天。在誘導過程中，需定期觀察細胞形態(tài)變化，并更換含D-半乳糖的培養(yǎng)基，一般每2 - 3天更換一次。     

4. 模型鑒定      

細胞形態(tài)觀察：衰老細胞通常會出現(xiàn)體積增大、扁平，細胞質內(nèi)顆粒增多等形態(tài)變化。可通過光學顯微鏡觀察并記錄細胞形態(tài)。 染色檢測：衰老相關β -半乳糖苷酶（SA - β - Gal）染色：這是鑒定細胞衰老的經(jīng)典方法。衰老細胞內(nèi)的 SA - β - Gal 活性升高，在 pH 6.0 的條件下可將X - Gal底物水解成藍色產(chǎn)物。通過染色后在顯微鏡下觀察，計算藍色染色細胞的比例，若比例明顯高于對照組，則表明細胞衰老模型建立成功。     
   （僅供參考）      
     

雙氧水誘導的細胞衰老模型建立     
    
  
 1. 細胞培養(yǎng)      

選擇合適的細胞系，如人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）、人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH - SY5Y）等。將細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，使用對應的適宜培養(yǎng)基，如含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期。    

2. 過氧化氫溶液配制      

一般來說，H?O?溶液的工作濃度在 50 - 200μmol/L 之間，具體濃度需根據(jù)不同細胞類型和實驗目的進行優(yōu)化。例如，對于HUVECs細胞，可先嘗試 100μmol/L 的 H?O?溶液。由于H?O?不穩(wěn)定，易分解，所以需要用新鮮的PBS或培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用。     

3. 誘導處理      

當細胞生長至合適密度（如70% - 80%匯合度）時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2 - 3次。然后加入含 H?O?的培養(yǎng)基，使 H?O?終濃度達到設定值。將細胞繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導時間通常為24 - 72小時。在誘導過程中，需密切觀察細胞狀態(tài)，避免細胞因 H?O?濃度過高或處理時間過長而死亡。 

4. 模型鑒定      

細胞形態(tài)觀察：衰老細胞會出現(xiàn)體積增大、形態(tài)不規(guī)則、細胞膜皺縮等變化?？赏ㄟ^光學顯微鏡觀察并記錄細胞形態(tài)。 染色檢測：同 D - 半乳糖誘導細胞衰老模型鑒定方法，衰老細胞內(nèi)的 SA - β - Gal 活性升高，染色后在顯微鏡下觀察，計算藍色染色細胞的比例，若比例明顯高于對照組，則表明細胞衰老模型建立成功。     
   （僅供參考）

染色結果： β-半乳糖苷酶陽性部位著藍色至藍綠色 （hela cell）