讓長讀取來拯救基因組組裝

更新時(shí)間：2013-05-09

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新一代測(cè)序的出現(xiàn)，讓科學(xué)家們能夠更快地實(shí)現(xiàn)基因組測(cè)序，且成本比Sanger測(cè)序要低得多。但是，這是以犧牲讀長為代價(jià)的，平均讀長從Sanger測(cè)序時(shí)的800-900 bp降低如今的100 bp左右。短的讀長讓基因組組裝更加困難，因?yàn)樾枰疃雀采w才能產(chǎn)生相當(dāng)?shù)慕M裝。為了解決這一問題，Worley及其同事近轉(zhuǎn)向了Pacific Biosciences公司的PacBio RS平臺(tái)。

然而，有些問題是更深度覆蓋也無法彌補(bǔ)的。對(duì)于de novo組裝，長度超過讀長的重復(fù)序列會(huì)產(chǎn)生缺口，導(dǎo)致近年來更多片段化的組裝。因此，我們很難檢測(cè)重復(fù)區(qū)域的變異，而這些對(duì)了解某些疾病可能很重要。

對(duì)此，貝勒醫(yī)學(xué)院人類基因組測(cè)序中心的遺傳學(xué)家Kim Worley談道：“令人沮喪的事情是100 bp讀取中沒有太多的信息內(nèi)容。”她指出，在恒河猴的基因組草圖中，高達(dá)20%的基因模型都含有缺口。

Worley表示：“我們已經(jīng)完成了人類基因組和小鼠基因組，而其他一切都仍未完成。即使是已經(jīng)完成的基因組，也有并不*連續(xù)和正確的區(qū)域，而用戶對(duì)那些區(qū)域的數(shù)據(jù)總是不滿意。”

為了解決這一問題，Worley及其同事近轉(zhuǎn)向了Pacific Biosciences公司的PacBio RS平臺(tái)。這是一種第三代測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)開展單分子測(cè)序反應(yīng)。該系統(tǒng)的平均讀長在幾kb，而某些情況下的大讀長能達(dá)到30 kb。

這些長的序列讀取簡化了基因組組裝，因?yàn)樗鼈兡軌蚩缭街貜?fù)區(qū)域，而且不需要DNA的擴(kuò)增，從而減少了某些測(cè)序假象和基因組覆蓋偏向。因此，PacBio RS平臺(tái)產(chǎn)生的長讀取無GC偏向或系統(tǒng)誤差，適用于基因組組裝的升級(jí)。

正如去年在《PLoS ONE》上介紹的，Worley及其同事開發(fā)出一種自動(dòng)的軟件工具，名為PBJelly。1 它能夠?qū)?/span>PacBio長讀取與組裝草圖比對(duì)，關(guān)閉或改善缺口，同時(shí)保留注釋。研究人員將這種方法應(yīng)用在四個(gè)基因組上，解決了63%-99%的缺口，能關(guān)閉32%-69%并改善12%-63%。

PacBio的科學(xué)官Jonas Korlach表示：“我們正在經(jīng)歷一場(chǎng)復(fù)興，一場(chǎng)已完成基因組的復(fù)興。在Sanger測(cè)序的年代，這是慣例，但是當(dāng)新一代技術(shù)到來時(shí)，它幾乎被拋棄，因?yàn)閹缀醪豢赡芡ㄟ^Sanger測(cè)序來結(jié)束那些基因組。”

從原理上說，PBJelly適用于任何平臺(tái)所產(chǎn)生的長序列讀取。不久之后，當(dāng)新一代測(cè)序公司趕上PacBio的讀長時(shí)，這一特征就顯得尤為重要。

正在朝這一方向努力的是Illumina公司。不久前，它收購了Moleculo公司，該公司開發(fā)的技術(shù)讓大的DNA片段可在Illumina標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序，隨后組裝成合成的長讀取。來自每個(gè)分子的短序列讀取分別組裝，終結(jié)果是所有片段的完整序列。從本質(zhì)上講，短讀取數(shù)據(jù)重建成長讀取。

在1月份召開的動(dòng)植物基因組大會(huì)上，一組科學(xué)家報(bào)告稱，Moleculo技術(shù)可利用Illumina HiSeq2000平臺(tái)，產(chǎn)生長度跨越1.5-15 kb的準(zhǔn)確DNA測(cè)序讀取。

另一個(gè)長讀取技術(shù)的范例是454的GS FLX+系統(tǒng)，它帶來了長度達(dá)1000 bp的讀取。眼下，一個(gè)研究協(xié)作組正在利用這種測(cè)序技術(shù)來分析和組裝RP11人類參考基因組，試圖關(guān)閉缺口并發(fā)現(xiàn)基因組序列中的新基因。

454生命科學(xué)研發(fā)部門的副總裁Todd Arnold表示：“454一直以高質(zhì)量、長讀取而著稱。”隨著讀長和通量逐步上升，“我們?cè)谠黾幼x長時(shí)也力爭(zhēng)保留我們的質(zhì)量值，因?yàn)檫@對(duì)我們的客戶非常重要。”

但根據(jù)Korlach的說法，現(xiàn)有的其他技術(shù)都無法與PacBio抗衡。他表示，目前存在根本的技術(shù)差異和限制，使得其他技術(shù)無法提供PacBio的連續(xù)讀長。

不過，PacBio長讀取技術(shù)也有缺點(diǎn)，那就是錯(cuò)誤率高。盡管通過環(huán)化測(cè)序可實(shí)現(xiàn)高度準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果，但PacBio RS儀器產(chǎn)生的單向讀取，平均準(zhǔn)確性只有87-89%。該公司負(fù)責(zé)產(chǎn)品管理的總監(jiān)Edwin Hauw表示：“我們正在努力改善這一點(diǎn)，但準(zhǔn)確性仍將在很長一段時(shí)間內(nèi)低于其他現(xiàn)有技術(shù)，因?yàn)槲覀兊募夹g(shù)是基于單分子的實(shí)時(shí)檢測(cè)。”

東京大學(xué)的計(jì)算生物學(xué)家Michiaki Hamada對(duì)那些錯(cuò)誤率不以為然。“在我看來，這些高錯(cuò)誤率不會(huì)帶來嚴(yán)重的問題，因?yàn)榇蟛糠皱e(cuò)誤可通過低錯(cuò)誤率的短讀取來校正，比如Illumina測(cè)序儀所產(chǎn)生的那些。”

在近的一項(xiàng)研究中，Hamada及他的團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種名為PBSIM的讀取模擬器，它捕獲了PacBio讀取的主要特征。Hamada表示，他們的長期目標(biāo)是開發(fā)出適用于長讀取的de novo組裝程序，但目前還沒有模擬器能針對(duì)PacBio文庫的生成。

Hamada及其同事利用PBSIM來分析13個(gè)PacBio數(shù)據(jù)集，結(jié)果發(fā)表在《Bioinformatics》上。2 在開展PacBio讀取的混合糾錯(cuò)和組裝檢測(cè)之后，他們發(fā)現(xiàn)，通過覆蓋深度少為15的連續(xù)長讀取，再加上覆蓋深度少為30的循環(huán)測(cè)序，可獲得大量的組裝結(jié)果。Hamada表示：“PBSIM不僅可用于組裝程序的評(píng)估，可能用于測(cè)序的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。”

由于參考基因組中的缺口可能包含了與疾病相關(guān)的基因，故長讀取技術(shù)的利用對(duì)臨床領(lǐng)域有重大影響。例如，Arnold及其同事鑒定出一個(gè)可能參與癌癥發(fā)展的區(qū)域。“有證據(jù)表明該基因來自早期的RNA序列數(shù)據(jù)，但它并未出現(xiàn)在參考基因組中，因此開展重測(cè)序研究的人員看不到。參考文庫越完整，你以積極方式使用這些數(shù)據(jù)的能力就越強(qiáng)。”

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