丁酰膽*酯酶（BchE）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5975

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入12mL試劑一，充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱血漿膽*酯酶，假性膽*酯酶，是一種*酸水解酶，由肝臟合成后進入血液，幾乎存在于所有動物組織中。BchE結(jié)構(gòu)與乙酰膽*酯酶（AchE）相似，但底物特異性和抑制劑敏感性不同。與AchE相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥等神經(jīng)毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點。

BchE催化丁酰膽*水解生成膽*，膽*與二硫?qū)ο趸郊姿幔?/span>DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm處有吸收峰，通過測定412nm吸光度增加速率，計算BchE活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）=1：5~10比例加入試劑一（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL試劑一），冰浴勻漿后，于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 血清/血漿等液體樣本：直接測定。若有渾濁請離心后取上清置于冰上待測。

3. 細(xì)菌、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量10⁴個：試劑一體積（mL）500~1000:1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時間3 min），于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列試劑）

三、BchE活性計算

A、用微量玻璃比色皿測定：

1. 按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每mg蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為1個酶活單位。

BchE活性(U/mg prot)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹] ÷（Cpr×V樣）÷T×F=308.8×ΔA÷Cpr×F。

2. 按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為1個酶活單位。

BchE活性(U/g 質(zhì)量)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T×F=308.8×ΔA÷W×F。

3. 按照血清/血漿等液體體積計算

活性單位定義：每mL血清/血漿每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為1個酶活單位。

BchE活性(U/mL)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷V樣÷T×F=308.8×ΔA×F。

4. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：每萬個細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為1個酶活單位。

BchE活性(U/10⁴ cell)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷（N×V樣÷V樣總）÷T×F=308.8×ΔA÷N×F

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.21mL=2.1×10^-4L；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=1×10⁹nmol；V樣：反應(yīng)體系加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min；F：樣本稀釋倍數(shù)；N：細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量，以萬計。

B、用96孔板測定：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。

注意事項：

1. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，請嚴(yán)格控制反應(yīng)時間，建議兩人進行實驗，一人加樣，一人計時。

2. 如果?A測定接近?A空白，可以增加樣本量后再進行測定；如果A2測定大于1或ΔA測定大于0.7，建議將樣本上清用試劑一適當(dāng)稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1018g大鼠肝臟樣本，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，離心后上清液用試劑一稀釋2倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定2-A測定1=0.636-0.417=0.219，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180= 0.008，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.211，按樣本質(zhì)量計算得（光徑為0.6cm帶入計算）：

BchE活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T×F =2133.49 U/g 質(zhì)量。

2. 取人血清樣本，用試劑一稀釋16倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定2-A測定1=0.960- 0.299=0.661，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180=0.008，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.653，按液體體積計算得（光徑為0.6cm帶入計算）：

BchE活性（U/mL）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷V樣÷T×F =5377.237 U/mL。

參考文獻：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Yücel YY, Tacal O, Ozer I. Comparative effects of cationic triarylmethane, phenoxazine and phenothiazine dyes on horse serum butyrylcholinesterase [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2008, 478(2): 201-205.

[3] Jońca J, ?uk M, Was?g B. et al. New Insights into Butyrylcholinesterase Activity Assay: Serum Dilution Factor as a Crucial Parameter [J]. PLoS ONE, 2015, 10(10).

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