乙酸激酶（ACK）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC3175
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將試劑九加入到提取液中，并于2-8℃保存；

2. 試劑二：臨用前每瓶加入1 mL蒸餾水，充分溶解待用。用不完的試劑仍2-8℃保存；

3. 試劑三：臨用前每瓶加入1 mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑-20℃保存；

4. 試劑四：臨用前每瓶加入2 mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑-20℃保存；

5. 試劑五：臨用前每支加入0.5 mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑-20℃保存；

6. 試劑六：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前根據(jù)樣本量將試劑六、蒸餾水按43:457（V:V）的比例配制備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

7. 試劑七：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前根據(jù)樣本量將試劑七、蒸餾水按1:9（V:V）的比例配制備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

8. 試劑八：臨用前加入5 mL蒸餾水，充分溶解待用。用不完的試劑仍2-8℃保存；

9. 工作液：吸取0.06 mL 試劑二、0.2 mL試劑三、0.13 mL試劑四、0.04 mL試劑五、0.04 mL試劑六、0.04 mL試劑七、0.2 mL試劑八混勻，也可根據(jù)比例現(xiàn)用現(xiàn)配，于冰上備用。

產(chǎn)品說明：
ACK廣泛存在于生物體內(nèi)，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。
測定原理如下：（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙 酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙 酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙 酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD⁺

速率，即可反映ACK活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
臺式離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項：

1. 測定過程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，比色皿測定時可取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3. ΔA大于1時，建議稀釋后測量，注意計算公式乘以稀釋倍數(shù)；ΔA小于0.01時，建議延長反應(yīng)時間測量，注意計算公式變化。

實驗實例：

1. 取0.1g腎臟組織樣本，加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A測定1-A測定2=1.7666-1.0488=0.7178，ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.7178-0.0349=0.6829，按樣本質(zhì)量計算酶活得：ACK（U/g 質(zhì)量）=536×ΔA÷W=536×0.6829÷0.1=3660.344 U/g 質(zhì)量。

2. 取500萬大腸桿菌加入1mL提取液超聲破碎，離心，取上清后按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定=A測定1-A測定2=1.3965-1.3503=0.0462，ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.0462-0.0349=0.0113，按細(xì)菌數(shù)量計算酶活得：ACK（U/10⁴ cell）=1.072×ΔA=1.072×0.0113=0.0121136 U/10⁴ cell。

參考文獻：

1. Mukhopadhyay S, Hasson M S, Sanders D A. A continuous assay of acetate kinase activity: Measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate[J]. Bioorganic chemistry, 2008, 36(2): 65-69.

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