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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4240-50T/48S
更新時間：2024-04-16
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：882
010-50973130
產品分類
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ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4240
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體0.6 mL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1支 |
溶液的配制：
1、 提取液二：為易揮發(fā)試劑，用完后盡快密封，-20℃保存；
2、 試劑二：臨用前加入1.3 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
3、 試劑三：臨用前加入6 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
4、 試劑四：臨用前加入1 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
5、 試劑五：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融；
6、 試劑五工作液：根據樣本量按照試劑五：蒸餾水=0.025mL：0.8mL（共0.825mL，約16T）的比例進行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當天用完；
7、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根據樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。
產品說明：
ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰*酶A的關鍵胞質酶，其催化產生的乙酰*酶A是合成脂肪酸與膽*醇等脂類物質的主要原料，并可參與相關重要蛋白的修飾作用，是體內能源物質代謝的樞紐性物質。
在ATP和*酶A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰*酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，導致340nm處光吸收下降。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、天平、臺式低溫離心機、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
2、細胞或細菌：按照細胞或細菌數量（104個）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細胞或細菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min），于4℃，8000g離心10min，取上清，置于冰上待測。
3、血清（漿）或其他液體：直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 將試劑一置于37℃水浴10min。
3、 操作表 (在1mL石英比色皿中依次加入下列試劑) ：
試劑名稱 | 測定管 | 空白管 |
試劑一（µL） | 760 | 760 |
試劑二（µL） | 20 | 20 |
試劑三（µL） | 100 | 100 |
試劑四（µL） | 20 | 20 |
試劑五工作液（µL） | 50 | 50 |
樣本（µL） | 50 | - |
蒸餾水（µL） | - | 50 |
在1mL石英比色皿中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃環(huán)境反應2min，拿出迅速擦干測定130s時的吸光值A2，計算ΔA測定管=A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 | ||
注意：如果樣本量大，可按試劑一︰試劑二︰試劑三︰試劑四︰試劑五工作液=760︰20︰100︰20︰50的比例配制成工作液使用，工作液應根據樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用。
三、ACL活性計算
1. 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位
ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/g 質量）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA÷W
3. 按照細胞數量計算
單位定義：每1萬個細胞或細菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL活性（U/104 cell）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）] ÷(N×V樣÷V樣總) ÷T=1607.7×ΔA÷N
4. 按液體體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×109÷（ε×d）]÷V 樣÷T=1607.7×ΔA
V反總：反應總體積，1×10-3 L；109：單位換算系數，1mol=109nmol；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；N：細胞或細菌數量，以萬計；T：反應時間，2min。
實驗實例：
1. 取0.1g黑麥草，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.549-1.512=0.037，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.037-0.001=0.036，按樣本質量計算得：
ACL活性（U/g 質量）=1607.7×ΔA÷W=578.772 U/g 質量。
2. 取0.1g肝臟組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，于4℃，8000g離心10min，取上清，按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.165-0.985=0.179，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.179-0.001=0.178，按樣本質量計算得：
ACL活性（U/g 質量）=1607.7×ΔA÷W=2861.706 U/g 質量。
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