乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC0750

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入3 mL 蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑四：為有毒試劑，實驗室注意防護；

3、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=300µL：100µL：20µL：30µL（1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）是醛脫氫酶的一種，能夠催化乙醛、正丁醛、肉桂醛、苯甲醛等有毒醛類快速脫氫，催化醛類物質(zhì)氧化生成羧酸，清除有害醛類并減少脂類的過氧化反應(yīng)，被認為是生物體內(nèi)活性氧物質(zhì)的解毒劑。乙醛脫氫酶不僅能夠轉(zhuǎn)化代謝對生物體有害的醛類，還在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面有較廣泛的研究應(yīng)用。

乙醛脫氫酶催化乙醛和NAD⁺轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計算得到乙醛脫氫酶的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，于4℃，10000g離心20min，取上清置于冰上待測。

2. 細胞/細菌樣本：按照細胞/細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例加入提取液（建議500萬細胞/細菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率300W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，10000g離心20min，取上清置于冰上待測。

3. 血清（漿）等液體：直接檢測。若液體有渾濁則離心后進行測定。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液37℃預(yù)熱10min。

3、 操作表：

三、ALDH酶活計算

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=26.795×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=26.795×ΔA÷W

3. 按細胞/細菌數(shù)量計算

酶活定義：每10⁶個細胞/細菌每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH酶活（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T=26.795×ΔA÷N

4. 按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=26.795×ΔA

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細胞/細菌總數(shù)，以10⁶計；T：反應(yīng)時間：30min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，其OD值不超過0.3，變化不超過0.01。

2、 樣本ΔA大于1，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時，可以延長反應(yīng)時間（60min或更長時間）來測定。計算時注意同步更改計算公式。

實驗實例：

1、 取0.1084g水稻葉片，加入1mL提取液進行冰浴勻漿研磨，離心取上清稀釋2倍，之后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測=0.844-0.758=0.086，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.094- 0.092=0.002，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.086-0.002=0.084，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH酶活（U/g質(zhì)量）=26.795×0.084÷0.1084×2 =41.527 U/g質(zhì)量。

2、 取0.1023g兔肝臟，加入1mL提取液進行冰浴勻漿研磨，離心取上清稀釋2倍，之后按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測=0.875-0.491=0.384，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.094-0.092= 0.002，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.384-0.002=0.382，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH酶活（U/g質(zhì)量）=26.795×0.382÷0.1023×2 =200.111 U/g質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻：

[1] Tongmeng Jiang,Jinmin Zhao,Shan Yu,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. January 2019;188:130-143.(IF5.452)

[2] Chong Li, Shi Gao, Xiaotong Li,et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018;(IF5.452)

[3] Yufei He,Xiaoyan Ci,Ying Xi,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. September 2018;(2019)188:130-143.(IF8.806)

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