線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ/NADH-CoQ還原酶活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0510
規(guī)格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：試劑放于瓶內玻璃管內，臨用前取一瓶加入2 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可分裝保存1個月；

2. 試劑三：臨用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮 易揮發(fā)，使用完畢后注意封口，-20℃可保存2個月；

3. 試劑三工作液：臨用前根據用量將試劑三：丙 酮=10μL：1mL（約20T）混合備用，現用現配；

4. 試劑四：臨用前取一瓶加入2.4mL蒸餾水（約30T），現用現配，充分溶解，-20℃可保存1個月，避免反復凍融；

5. 工作液的配制：根據用量將丙 酮：試劑二：試劑三工作液=250μL：250μL：500μL（約10T）混合備用，現配現用。

產品說明：
復合體Ⅰ（EC 1.6.5.3）又稱NADH-CoQ還原酶或NADH脫氫酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是線粒體內膜中最大的蛋白復合物。該酶催化一對電子從NADH傳遞給CoQ，同時可使O₂還原生成O^2-，是呼吸電子傳遞鏈上產生O^2-的主要部位。測定該酶活性，不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈（ETC）狀態(tài)，而且可以反映活性氧（ROS）生成狀態(tài)。
復合體Ⅰ能夠催化NADH脫氫生成NAD⁺，在340nm下測定NADH的氧化速率計算出該酶活性的大小。


注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、細胞超聲破碎儀、丙 酮、冰和蒸餾水。
操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1.0 mL提取液一，用勻漿器或研缽于冰上快速勻漿（約30次）。

2. 4℃ 600 g離心10min，棄沉淀，留上清。上清再次離心，4 ℃ 11000 g離心15min，得到上清液和沉淀。

3. 上一步結果得到的上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4. 在沉淀中加入200μL提取液一和200μL 提取液二，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復15次），用于復合體Ⅰ酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1. 紫外分光光度計預熱30min 以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 試劑一37℃預熱15min。

3. 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入

三、復合體Ⅰ活力單位的計算
（1） 按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T =3215.43×ΔA÷Cpr
V反總：反應體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，1min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（A1高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 樣本蛋白濃度需自行測定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（約0.5mg/mL）。

3. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活。另附按樣本計算公式和按細胞數量計算公式

4. 附：使用樣本重量計算公式：（樣本檢測數為50T/24S） 

A、上清中復合體I活力的計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/g質量）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=3215.43×ΔA1÷W
ΔA1：上清測定值；V反總：反應體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：
比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫?/span>一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，1min；W：樣本質量，g；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復合體I活力的計算：
單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/g質量）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。撼恋碇貞殷w積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，1min；W：樣本質量，g；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復合體I總活力的計算：
樣本復合體I總活力即為上清中復合體I活力與沉淀中復合體I活力之和。
按樣本質量計算：復合體I（U/g 質量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W

1. 附：使用細胞數量計算公式：（樣本檢測數為50T/24S） 

1. 上清中復合體I活力的計算：

單位的定義：每10⁶個細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T =3215.43×ΔA1÷N
ΔA1：上清測定值；V反總：反應體系總體積，10^-3L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫?/span>一體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，1min；N：細胞數量，以10⁶計；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。

1. 沉淀中復合體I活力的計算:

單位的定義：每10⁶個細胞在反應體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V樣)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L/mol/cm d：比色皿光徑，1cm；V提取：沉淀重懸體積（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應時間，1min；N：細胞數量，以10⁶計；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。

1. 樣本復合體I總活力的計算：

樣本復合體I總活力即為上清中復合體I活力與沉淀中復合體I活力之和。
復合體I總活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
相關發(fā)表文獻：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

參考文獻：

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2. Eike L, Jakob M C, Julian D L, et al. Conformational changes in mitochondrial complex I from the thermophilic eukaryote Chaetomium thermophilum [J]. Science Advances, 2022, 8(47): 419-429.

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