精*酸（Arg）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

貨號(hào)：BC5635

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入0.6mL無(wú)水乙醇，充分溶解。-20℃可以保存4周。

2、 工作液配制：按照試劑一︰試劑二=10μL：90μL（100μL，2T）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入0.918mL蒸餾水，充分溶解，配制成62.5 μmol/mL 精*酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前取10μL的62.5 μmol/mL 精*酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于EP管中，加入790 μL蒸餾水充分溶解，配制成0.78125 μmol/mL的精*酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

精*酸(Arginine)是人體和動(dòng)物體內(nèi)的半必需氨基酸，在機(jī)體中參與蛋白質(zhì)的合成代謝、以及多胺和NO的合成，起著重要的生理作用。精*酸有降低血壓的作用，在體內(nèi)精*酸能夠分解成為一氧化氮，一氧化氮能松弛血管壁平滑肌，調(diào)節(jié)血管彈性，對(duì)血管內(nèi)膜有修復(fù)作用。精*酸能夠刺激并誘導(dǎo)腎上腺激素分泌，從而降低血糖，減少身體中脂肪酸的生產(chǎn)，能使高血糖患者的血糖降至正常水平。

精*酸在堿性介質(zhì)中與甲萘酚和次氯酸鈉生成紅色生成物，其在525nm處有特征吸收峰，以此計(jì)算精*酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、渦旋混勻儀、分析天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水、無(wú)水乙醇和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液一體積（mL）為5~1：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 在1.5mL EP管或96孔板中按下表步驟加樣：

三、精*酸（Arg）含量計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

Arg含量（μmol/mg prot）=C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_樣÷（Cpr×V_樣）×F=0.781×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

Arg含量（μmol/g 質(zhì)量）= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×（V_上清+V_提取液二）÷（W×V_上清÷V_提取液一）×F

= 0.928×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

Arg含量（μmol/10⁶ cell）= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×（V_上清+V_提取液二）÷（N÷V_上清÷V_提取液一）×F
= 0.928×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷N×F

(4) 按液體體積計(jì)算

Arg含量（μmol/mL）= C_{標(biāo)準(zhǔn)}×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×（V_上清+V_提取液二）÷（V_液體×V_上清÷（V_液體+V_提取液一））×F

= 10.205×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}：精*酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.78125μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.05mL；V_上清：提取時(shí)上清的體積，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的體積，1mL；V_液體：液體樣本體積，0.1mL；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，以10⁶計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。.

注意事項(xiàng)：

1. 如果?A_測(cè)定大于1.2，可以用蒸餾水對(duì)樣本進(jìn)行稀釋；如果?A_測(cè)定過(guò)小，可以加大樣本量。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量，需另取組織。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1162g小鼠腎臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_空白=0.524-0.232=0.292，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.575-0.232=0.343，帶入公式計(jì)算：

Arg含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.928×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W=6.799 μmol/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1186g花生組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_空白=0.556-0.232=0.324，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.575-0.232=0.343，帶入公式計(jì)算：

Arg含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.928×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W=7.391 μmol/g 質(zhì)量

3、 取人血清按按前處理和實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用96孔板測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_空白=0.3-0.232=0.068，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.575-0.232=0.343，帶入公式計(jì)算：

Arg含量（μmol/mL）=10.205×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F =2.023 μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Francis P S, Barnett N W, Foitzik R C, et al. Chemiluminescence from the Sakaguchi reaction [J]. Analytical Biochemistry, 2004, 329(2):340-341.

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