土壤碳酸酐酶（S-CA）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

可見分光光度法

貨號(hào)：BC5500

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支試劑二，先加入1mL丙酮使粉劑充分溶解，再加入10mL蒸餾水。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以分裝保存1周，避免反復(fù)凍融。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取50μL的5μmol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液于試劑瓶中，加入750μL蒸餾水充分混合，配置成0.3125 μmol/mL的酚標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase, CA, EC4.2.1.1）是一種以 Zn²⁺為活性中心的金屬酶，可用來(lái)高效催化 CO₂ 的可逆水合反應(yīng)：CO₂+H₂0?HCO₃^-+H⁺，催化速率可達(dá)自然條件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸對(duì)硝基苯酯反應(yīng)生成對(duì)硝基苯*，通過(guò)檢測(cè)405nm處吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、30-50目篩、研缽、分析天平、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、甲苯、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

新鮮土樣自然風(fēng)干或 37℃烘箱風(fēng)干，過(guò) 30~50目篩。

二、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一使用前37℃預(yù)熱15min。

3、 標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定：在2mL EP管內(nèi)中加入320μL標(biāo)準(zhǔn)液，1180μL試劑一，充分混勻后，于1mL玻璃比色皿中測(cè)定405nm處吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)}。

（2） 標(biāo)準(zhǔn)空白管測(cè)定：在2mL EP管內(nèi)中加入320μL蒸餾水，1180μL試劑一，充分混勻后，于1mL玻璃比色皿中測(cè)定405nm處吸光值，記作A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。

（3） 計(jì)算?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

4、 操作表：（在2mLEP管內(nèi)加入）

三、土壤CA活性計(jì)算

按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃，每g土壤每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 對(duì)硝基苯*定義為一個(gè)酶活力單位。

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）=C_標(biāo)×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×V_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W÷T×F=0.02×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

C_標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.3125μmol/mL；V_{標(biāo)準(zhǔn)}：反應(yīng)體系中加入的標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.32mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min； W：樣本質(zhì)量，g；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、 如果A測(cè)定大于1.5或者?A大于0.8，可以減少樣本量或者縮短37℃酶促反應(yīng)時(shí)間；?A小于0.02，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)37℃酶促反應(yīng)時(shí)間。注意計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

2、 如果離心后待測(cè)的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或延長(zhǎng)時(shí)間，例如20000g，4℃離心10min。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.2014g土壤樣本65號(hào)，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算?A =A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.595-0.400=0.195，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.448-0=0.448，帶入公式計(jì)算：

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.02×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =0.043 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.2015g土壤樣本1號(hào)，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算?A =A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.275-0.137=0.138，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.448-0=0.448，帶入公式計(jì)算：

S-CA活性（U/g 質(zhì)量）=0.02×?A÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =0.031 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Li W, Yu L J, Yuan D X, et al. A study of the activity and ecological significance of carbonic anhydrase from soil and its microbes from different karst ecosystems of Southwest China[J]. Plant and Soil, 2005, 272(1):133-141.

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