羥甲基戊二酰輔*A合成酶（HMGCS）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5430

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解。-20℃分裝以保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑一工作液的配制：按照試劑一：蒸餾水=50μL：1150μL（1.2mL，約9T）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，當天用完。

3、 試劑二：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解。-20℃分裝以保存4周，避免反復(fù)凍融。

4、 試劑二工作液的配制：按照試劑二：蒸餾水=100μL：1100μL（1.2mL，約9T）的比例配制，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，當天用完。

產(chǎn)品說明：

甲羥戊酸途徑 是一個非常重要的代謝途徑，參與許多重要萜類的前體物的合成，是萜類生物合成的重要途徑。羥甲基戊二酰輔*A合成酶催化乙酰CoA和乙酰乙酰CoA，生成羥甲基戊二酰輔*A，是膽*醇和類異 戊二烯生物合成中的關(guān)鍵步驟。

HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時產(chǎn)生CoASH，使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），

進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、 測定步驟

1. 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 根據(jù)樣本量取部分試劑一工作液、試劑二工作液、試劑三于37℃預(yù)熱10min。

3. 操作表：（在微量玻璃比色皿中加入下列試劑）

將上述試劑加入微量玻璃比色皿中充分混勻，于412nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴鍋或者恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20min，拿出迅速擦干測定20min10s時的吸光值A2，記錄412nm下10s時吸光值A1和20min后的吸光值A2。計算ΔA測定=A2測定-A1測定，ΔA空白=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。

三、HMGCS活性計算

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為一個酶活力單位。

HMGCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=7.353×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為一個酶活力單位。

HMGCS活性（U/g 質(zhì)量）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=7.353×ΔA÷W

3. 按細胞/細菌數(shù)量計算

酶活定義：每10⁶個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB為一個酶活力單位。

HMGCS活性（U/10⁶ cell）＝ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹÷（N×V樣÷V樣總）÷T=7.353×ΔA÷N

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.5mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，20min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細胞或細菌總數(shù)，以10⁶計。

注意事項：

1. 如果ΔA吸光值過低或接近空白，適當延長反應(yīng)時間或加大樣本量后，重新測定。注意同步修改計算公式。

2. 如果A2＞1或者ΔA＞0.8，建議將樣本適當稀釋后或者縮短反應(yīng)時間進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.1046g平菇，加入提取液進行冰浴勻漿，提取液將上清稀釋2倍，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A2測定-A1測定=0.901-0.565=0.336，?A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，?A=?A測定-?A空白=0.289，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

HMGCS活性（U/g 質(zhì)量）＝7.353×ΔA÷W×2=40.63 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1070g青椒，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算?A測定=A2測定-A1測定=0.476-0.340=0.136，?A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，?A=?A測定-?A空白=0.089，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

HMGCS活性（U/g 質(zhì)量）＝7.353×ΔA÷W=6.12 U/g 質(zhì)量

參考文獻：

[1] Skaff D A, Miziorko H M. A visible wavelength spectrophotometric assay suitable for high-throughput screening of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 396(1):96-102

[2] Scharnagl H, W M?rz, Schliack M, et al. A novel assay for cytosolic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase activity using reversed-phase ion-pair chromatography: demonstration that Lifibrol (K12.148) modulates the enzyme activity[J]. Journal of Lipid Research, 1995, 36(3):622-627.

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