唾液酸（SA）含量檢測試劑盒

可見分光光度法

貨號：BC5360

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液配制：

標(biāo)準(zhǔn)品：4mmol/L唾液酸標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

唾液酸（Sialic acid，SA），又稱N-乙酰神經(jīng)氨酸，是細(xì)胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分，其廣泛的存在于生物體中，參與細(xì)胞表面的多種生理功能。

唾液酸在氧化劑存在的情況下與5-甲基間*二酚形成紫紅色絡(luò)合物，其在560nm處有最大吸收峰，通過測定產(chǎn)物在560nm的吸光值，可以計算出唾液酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照樣本質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿；3000rpm 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），3000rpm 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3. 乳液樣本：10000g 4℃離心10min后，去除上層的油脂后使用。

4. 其他液體樣本：直接測定（如有渾濁，可離心后使用）。

二、測定步驟

1、可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至560nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在EP管中按下表步驟加樣：

     100℃沸水浴15min，冷卻至常溫，8000rpm，常溫離心10min（如果待測液依舊渾濁，可以加大離心轉(zhuǎn)速）吸取1mL上清，于560nm處測定吸光值，分別記為A測定、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白。分別計算ΔA測定=A測定-A空白，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白（標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做1-2次）。

二、唾液酸含量的計算

（1）按樣本蛋白質(zhì)濃度計算（蛋白濃度需自行測定）：

唾液酸含量（mmol/g prot）= ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷（Cpr×V樣總×1000）
= 0.004×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

唾液酸含量（mmol/g 質(zhì)量）= ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷W=0.004×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算：

唾液酸含量（mmol/10⁴ cell）= ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣總÷N= 0.004×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

（4）按照液體樣本體積計算：

唾液酸含量（mmol/L）= ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

V樣總：加入提取液之后的樣本體積，0.001L；C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，4mmol/L；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞數(shù)量，萬個；1000：換算系數(shù)，1L=1000mL。

注意事項：

1、 100℃沸水浴溫度比較高，建議使用封口膜為離心管纏口，或使用螺旋蓋的離心管。

2、 ΔA測定的數(shù)值范圍在0.005-0.6之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。

實驗實例：

1. 吸取40μL牛血清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得A測定 = 0.291，A空白 = 0.002，?A測定= 0.289，A標(biāo)準(zhǔn) = 0.415，?A標(biāo)準(zhǔn) = 0.413。按液體樣本體積計算唾液酸含量得：

唾液酸含量（mmol/L）=  4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=2.799 mmol/L。

2. 吸取40μL血漿，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得A測定 = 0.227，A空白 = 0.002，?A測定= 0.225，A標(biāo)準(zhǔn) = 0.415，?A標(biāo)準(zhǔn) = 0.413。按液體樣本體積計算唾液酸含量得：

唾液酸含量（mmol/L）=  4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=2.179 mmol/L。

3. 稱取0.123g小鼠肝臟，加入1mL提取液，冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得A測定 = 0.07，A空白 = 0.002，?A測定 = 0.068，A標(biāo)準(zhǔn) = 0.415，?A標(biāo)準(zhǔn) = 0.413。按樣本質(zhì)量計算唾液酸含量得：

唾液酸含量（mmol/g 質(zhì)量）= 0.004×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.0054 mmol /g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yongpoovorawan, S. O. C. , Role of serum total sialic acid in differentiating cholangiocarcinoma from hepatocellular carcinoma[J]. World Journal of Gastroenterology,2003,9(10):2178-2181.

[2] Lu yiqin , Glycophorin variants and contents of sialic acid and total sulfhydryl groups on erythrocyte membranes of residents in a malaria hyperendemic area[J]. Chinese Medical Journal,1998,111(7):606-609.

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