乙酰乙酸（AcAc）含量檢測試劑盒（WST法）說明書

                                          微量法

貨號：BC5075

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入600μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周。避免反復(fù)凍融。（試劑三由于不便保存，故多給一支）

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 乙酰乙酸鋰。臨用前加入950μL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液。-20℃分裝保存4周。

4、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一、試劑二、試劑三按照170:8:2（180μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說明：

乙酰乙酸(AcAc)是酮體的重要成分之一，約占正常人酮體總量20%，是脂肪酸通過氧化產(chǎn)生的,是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸。正常含量的乙酰乙酸對人體無害，糖尿病患者由于糖的利用降低，或饑餓時由于糖的代謝障礙，大量動用脂肪，乙酰乙酸的量都會積累。乙酰乙酸即可轉(zhuǎn)化成丙酮，也可以轉(zhuǎn)化成β-羥丁酸。

在檢測中，乙酰乙酸通過偶聯(lián)酶反應(yīng)產(chǎn)生450nm吸收峰的產(chǎn)物，與存在的乙酰乙酸成比例。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、超聲波細(xì)胞破碎儀、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1: 5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000 g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等其它液體樣本：直接測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將80mg/mL 乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋至0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3、 按下表步驟加樣：

三、AcAc含量計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）。

2、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

AcAc含量（μmol/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷108.02×1000÷108.02=9.258x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

AcAc含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×1000÷108.02=9.258x÷W

（3）按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計算

AcAc含量（μmol/10⁴ cell）=x×V樣÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷108.02×1000=9.258x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

AcAc含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣÷108.02=9.258x

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20 μL=0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以10⁴計；V樣總：加入提取液體積，1 mL；108.02：乙酰乙酸鋰分子量，mg/mmol。

注意事項：

1、顯色完成后，請在15min之內(nèi)完成檢測。

2、如果測定吸光值低于或超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1. 取20 μL 牛血清按上述步驟進(jìn)行實驗，用96孔板測定后進(jìn)行計算ΔA測定=A空白-（A測定-A對照）=0.802-（0.837-0.076）=0.041，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.2259x+0.0145，計算x=0.117。計算

AcAc含量（μmol/mL）=9.258x=1.082μmol/mL

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