磷脂酶D（PLD）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2415

規(guī)格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1．提取液二：試劑易揮發(fā)，用完后快速擰蓋，封口膜纏口；

2．試劑三：試劑放于試劑瓶內玻璃管中臨用前取一支加入1.26 mL乙醇充分溶解后取上清使用；2-8℃可以分裝保存2周，避免反復凍融；

3．標準品：50umol/mL 膽*溶液，臨用前用試劑一稀釋100倍即500nmol/mL標準溶液備用（可以取10μL50umol/mL 膽*溶液加入990μL試劑一混勻即500nmol/mL標準溶液 ）。

產品說明：

磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）催化水解磷脂酰膽*末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽*，膽*在膽*氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安*比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質，在500nm處有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、超速冷凍離心機、可調式移液槍、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水、無水乙醇和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2、 細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3、 血清（漿）：直接測定。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預熱30min 以上，調節(jié)波長到500nm，分光光度計蒸餾水調零。

2、 樣本測定：

三、酶活計算

1、 按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。

PLD活性 (U/mg prot) =ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷(Cpr×V提取)÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2、 按樣本質量計算

酶活定義：每克組織每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位

PLD活性 (U/g 鮮重) = ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷W÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3、 按細菌或細胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。

PLD活性(U/10⁴ cell）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V提取÷細胞數(shù)量÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準÷細胞數(shù)量

4、 按血清（漿）計算：

酶活定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽*產生1nmol膽*所需的酶量一個酶活力單位。

PLD活性（U/mL）= ΔA測定÷ΔA標準×C標準×V血清（漿）÷V血清（漿）÷T = 16.7×ΔA測定÷ΔA標準

C標準：標準液濃度，500nmol/mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積（提取液一+提取液二），1mL；V血清（漿）：血清（漿）體積，0.02mL；W：樣本質量，g；細胞數(shù)量：以萬計；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，30min。

注意事項：

1. 顯色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃離心5min后取上清測定。

2. 吸光值不宜超過1，否則用試劑一將酶液進行稀釋，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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