一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒說明書（酶法測定總NO）

微量法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC1475

規(guī)格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前加入1.8 mL蒸餾水，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2、 試劑二：臨用前加入1mL蒸餾水，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3、 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑二：蒸餾水=10μL：590μL（60T）的比例配制，當天用完；

4、 試劑三：臨用前加入550μL蒸餾水溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

5、 試劑五：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑五：蒸餾水=5μL：225μL（23T）的比例配制試劑五溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

6、 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液：顯色液B液=1:1充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

7、 澄清劑：臨用前加入6mL蒸餾水，可震蕩或50℃加熱促進溶解。此溶液為飽和溶液，取上清使用即可。2-8℃可保存12周；

8、 標準液：10μmol/mL亞硝*。臨用前取20μL 10μmol/mL標準液，加入380μL蒸餾水，配制成0.5μmol/mL標準液，再取0.5μmol/mL標準液50μL和蒸餾水450 μL混合配制成0.05μmol/mL標準溶液。

產品說明：

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，分子小，結構簡單，常溫下為氣體，微溶于水，具有脂溶性，可快速透過生物膜擴散，作為一種新型的生物信使分子，在細胞間及細胞內發(fā)揮傳遞信號的作用。其廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中。在機體神經、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中也起著十分重要的作用。

NO在體內或水溶液中極易氧化生成NO₂^-和NO₃^-，本法利用硝酸還原酶特異性將NO₃^-還原成NO₂^-，在酸性條件下，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算NO含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建議稱取0.2g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，12000rpm，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 細菌/細胞樣本：按細菌/細胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例加入提取液（建議1000萬細菌/細胞加入1.0mL提取液），冰浴超聲破碎細菌/細胞（功率200w，超聲3s，間隔7s，總時間5min），然后于4℃，12000rpm，離心15min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

3. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

二、測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至550nm，分光光度計蒸餾水調零。

2．操作表：

三、NO含量計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

NO含量（μmol/mg prot）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(V樣×Cpr) = 0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2. 按樣本質量計算

NO含量（μmol/g 質量）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(W×V樣÷V樣總) = 0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3. 按細菌/細胞數(shù)量計算

NO含量（μmol/10⁴ cell）=ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷(V樣×N÷V樣總) = 0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷N

4. 按液體體積計算

NO含量（μmol/mL）= ΔA測定×（C標÷ΔA標準）×V樣÷V樣= 0.05×ΔA測定÷ΔA標準

C標：標準管濃度，0.05μmol/mL；V樣：加入樣本體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g ；N：細菌/細胞總數(shù)，以10⁴計。

注意事項：

1、 如果樣本勻漿液離心后上清仍舊渾濁，可直接進行反應，反應后在200μL反應液中加入50μL澄清劑，混勻后靜置5min，離心后取200μL上清測定，這種情況下需將空白管和標準管進行相同處理。

2、 如果?A測定小于0.005或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進行測定；如果?A測定大于0.6，建議將樣本上清用提取液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

3、 如果樣本上清有顏色（在550nm下有吸收峰），則需要補測樣本的對照管，即將顯色液用相同體積的蒸餾水代替。在550 nm下測定吸光值A，分別記為 A標準、A測定、A空白、A對照，計算ΔA標準=A標準-A空白，ΔA測定=A測定-A對照。此時試劑盒規(guī)格為100T/48S。

實驗實例：

1. 取0.107g玉蘭葉片樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.172-0.045=0.127，ΔA標準=A標準-A空白=0.526-0.045=0.481，按樣本質量計算得：

NO含量（μmol/g 質量）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.05×0.127÷0.481÷0.107=0.123 μmol/g 質量。

2. 取0.0868g小鼠心臟樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.187-0.045=0.142，ΔA標準=A標準-A空白=0.526-0.045=0.481，按樣本質量計算得：

NO含量（μmol/g 質量）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準÷W = 0.05×0.142÷0.481÷0.0868=0.170 μmol/g 質量。

3. 取60μL牛血清樣本，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定-A空白=0.326-0.045=0.281，ΔA標準=A標準-A空白=0.526-0.045=0.481，按液體體積計算得：

NO含量（μmol/mL）=0.05×ΔA測定÷ΔA標準 = 0.05×0.281÷0.481=0.029 μmol/mL。

相關發(fā)表文獻：

[1] Peng X, Zhu L, Guo J, et al. Enhancing biocompatibility and neuronal anti-inflammatory activity of polymyxin B through conjugation with gellan gum[J]. International journal of biological macromolecules, 2020, 147: 734-740.

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